如何快速检测细胞增殖？脱色摇床

介绍

目前检测细胞增殖能力的方法主要有两种：

一种是直接法，通过直接测定分裂细胞的数量来评估细胞的增殖能力，例如Ki67细胞增殖试验、BrdU细胞增殖试验、EdU细胞增殖试验等。

另一种是间接方法，即细胞活力检测法，通过检测样本中健康细胞的数量来评估细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法不能最终证明测试样本中的细胞是否在增殖。例如：MTT法、CCK8试剂盒法。

MTT 比色法：

是检测细胞存活和生长的一种方法。其检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞内，而死细胞则无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞内的甲臜，用酶联免疫吸附法在490nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，形成的MTT晶体量与细胞数成正比。

‚CCK8试剂盒方法：

CCK-8试剂盒是基于WST-8的快速高灵敏检测试剂盒，广泛应用于细胞增殖和细胞毒性。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子偶联剂存在下，可被线粒体中的一些脱氢酶还原，生成橙黄色的甲臜。CCK-8的原理其实和MTT是一样的，不同之处在于CCK-8法生成的甲臜是水溶性的，不需要抽吸培养基再加入有机溶剂溶解，从而减少了一定的误差。

ƒKi67 细胞增殖试验：

Ki-67抗体可识别同名蛋白，该蛋白在细胞周期的S、G2和M期表达，但不在G0和G1期（非增殖期）表达。抗Ki-67蛋白的单克隆抗体可用于检测细胞增殖。

“Brdu 细胞增殖试验：

“Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可以在DNA合成期（S期）替代胸腺嘧啶，可注射入体内或加入细胞培养中，然后用抗Brdu单克隆抗体和ICC染色显示增殖细胞。同时结合其他细胞标志物，双重染色可确定增殖细胞的类型和增殖速度，对细胞动力学研究有重要意义。”

但由于抗体分子量较大，很难掺入并有效检测，因此BrdU检测需要使用DNA酶或HCl或加热使DNA变性。对于有细胞壁的植物细胞的分析，抗体检测还需要对细胞壁进行消化。细胞壁消化酶中往往含有一些杂质，这会降低检测的可靠性。同时，BrdU检测需要长时间孵育——几个小时甚至过夜。

EdU细胞增殖测定：

EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）是一种胸苷类似物，在细胞增殖期可取代胸腺嘧啶（T）渗入复制中的DNA分子中，通过EdU与Apollo荧光染料的特异性反应，可快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等研究，尤其适用于siRNA、miRNA、小分子化合物等药物的筛选实验。

与BrdU检测方法相比，EdU检测方法速度更快、灵敏度更高、准确性更高。EdU染料仅为BrdU抗体的1/500，且易在细胞内扩散；不需要DNA变性（酸水解、热水解、酶水解等），可有效避免样品损伤；不需要抗原抗体反应，能更准确地反映细胞及组织水平的DNA复制活性。

BrdU 与 EdU 方法的比较：

EdU实验步骤：

（1）实验准备：1×细胞PBS（pH 7.4），通透剂（含0.5％TritonX-100的PBS），甘氨酸溶液（2 mg/mL），细胞固定剂（含4％多聚甲醛的PBS）。

（2）细胞培养：取对数生长的细胞，接种于96孔板中，每孔4×103～4×105个细胞，培养至正常生长阶段；

（3）转染或加药培养；

（4）EdU标记：（此步骤必须在洁净工作台上完成）

a.将EdU溶液（试剂A）用细胞培养基按1000:1的比例稀释，配制适量的50μM EdU培养基；

b. 每孔加入100μL 50μM EdU培养基，孵育2小时，弃去培养基；

c. 用PBS清洗细胞1-2次，每次5分钟，洗去未浸润DNA的EdU。

（5）细胞固定化：

a. 每孔加入50 μL细胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS），室温孵育30分钟，弃去固定液；

b. 每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸，置于脱色摇床中孵育5分钟，弃去甘氨酸溶液，以中和多聚甲醛，确保染色反应体系；（注：甘氨酸溶液需用去离子水配制，临用前配制）

c. 每孔加入100 μL PBS，在脱色振荡器上洗涤5分钟，弃去PBS；

d. 每孔加入100 μL通透剂（0.5% TritonX-100 in PBS），在脱色振荡器上孵育10分钟。用PBS清洗一次，每次5分钟。

（6）阿波罗染色：

a. 每孔加入100 μL 1×Apollo染色反应液，室温避光置于脱色摇床中孵育30分钟，弃去染色反应液。Apollo®染色液配制参考表2-13；（注意：临用前配制，按顺序加入试剂，30分钟内用完，避免影响反应体系；试剂E为粉末，易氧化，操作时要小心，如氧化成黄色，可能无效）

b. 加入100 μL通透剂（0.5% TritonX-100 in PBS），在脱色振荡器上洗涤2-3次，每次10分钟，弃去通透剂；

c. 由于部分细胞对染料的吸附量较大，需要进行强化洗脱以降低染料背景。（强化）每孔加入100 μL甲醇，洗涤1～2次，每次5分钟，用PBS洗涤1次，每次5分钟。

（7）DNA染色：

a.将试剂F用去离子水按100:1的比例稀释，配制适量的1×Hoechst33342反应溶液，避光保存；

b.每孔每次加入100μL1×Hoechst33342反应液，置于脱色摇床中室温避光孵育30分钟，弃去染色反应液；

c. 每次每孔加入100 μL PBS，清洗1-3次，每孔加入100 μL PBS留用。

（8）图像采集与分析：用激光共聚焦显微镜观察并拍照，避光保存。（注：4℃湿润状态下保存，但不得超过3天。）

结尾

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